Viral suppressor HCPro induce the expression of YUC1 in Arabidopsis thaliana

Jin Taicheng　Lang Chenjing　Wang Yue　Wu Yanju　Meng Dawei　Yang Liping ^*

The School of Life Science, Jilin Normal University, Siping, 136000

* Corresponding author, yangliping781124@163.com

Abstract　Auxin plays an important role in plant growth and development, viral infection affects host auxin accumulation. In this study, we revealed the molecule mechanism by which the viral suppressor HCPro activated the expression of auxin biosynthetic gene in plants. We transiently expressed the foreign gene GUS and the viral suppressor HCPro in Arabidopsis thaliana by using Agrobacterium-mediated leaf-infection. The results confirmed that HCPro can induce the DNA demethylation of YUC1 gene promoter and activate the gene expression in plants, and provided a basis for study on the molecule mechanism of interaction between virus and host.

Keywords　Arabidopsis thaliana, Leaf-infection, Auxin biosynthetic gene

植物中外源基因的表达方法包括稳定表达和瞬时表达两种方式(Walmsley and Arntzen, 2000)，瞬时表达体系具有简单、快速和高效等优势(Shivprasad et al., 2000)。农杆菌介导的叶片注射法是一种在植物中瞬时表达外源基因的常用方法。人们利用这种侵染方法在离体烟草叶片中瞬时表达了多种外源蛋白(Kathuria et al., 2002; Wang and Li, 2002)。有研究者利用农杆菌介导的叶片注射法在烟草(N.tabacum)中高水平表达了绿色荧光蛋白(GFP) (Jia et al., 2003)。Liu等利用叶片注射法在烟草中成功地表达了人表皮酸性成纤维细胞生长因子(ha FGF) (Liu et al., 2007)。2008年，Yang等利用根部吸收法在烟草中瞬时表达了GFP (Yang et al., 2008)。2013年，我们利用农杆菌侵染新技术在豌豆中瞬时表达haFGF (杨丽萍等, 2013)；2016年，我们在烟草中建立并优化了根部真空侵染法，并用此方法成功高效表达了外源基因。研究表明，这些瞬时表达体系和侵染方法的研究为植物生物反应器的研究提供了基础依据，也为药用蛋白和疫苗的快速生产提供了平台。

YUC基因是生长素生物合成基因，该基因家族共有11个成员(Cheng et al., 2006)。YUC基因在生物发育中至关重要，YUC基因表达的变化会影响生长素的生物合成，YUC基因的过量表达也会导致植物发育异常。例如，YUC6转基因植株叶片生长素水平升高，YUC8和YUC9的过度表达导致拟南芥的茎和叶的异常表型。本研究中，我们利用农杆菌介导的叶片侵染法在拟南芥(Arabidopsis thaliana)植物中瞬时表达报告基因GUS。我们利用这种侵染方法在拟南芥植物中表达了病毒抑制子HC-Pro，基因表达的检测结果揭示HC-Pro能够诱导YUC1的表达；亚硫酸盐测序结果证明HCPro能够诱导YUC1基因启动子DNA去甲基化而激活其基因表达，为病毒与宿主互作的分子机制研究奠定了基础。

1结果与分析

1.1利用农杆菌介导法表达GUS基因

首先，我们将pCAMBIA2301-GUS表达载体转化农杆菌EHA105，然后利用农杆菌介导的叶片侵染法在拟南芥中瞬时表达GUS报告基因，并进行了连续14天的观察和拍照记录。利用GUS化学组织染色法检测了GUS基因在拟南芥中的表达。结果表明：在农杆菌侵染后第7天，GUS开始在注射的伤口部位表达(图1A)；在农杆菌侵染后第10天，农杆菌通过微管束向四周传递，可以观察到GUS在侵染叶片中由伤口部位向外扩散表达(图1B; 图1C)；在注射后的第14天，GUS在未侵染的茎中(图1D)和新生叶片中大量表达(图1E)。

1.2拟南芥中GUS基因的快速表达

提取侵染后第7~10天的植物材料进行基因表达检测，结果表明：在拟南芥中报告基因GUS被成功表达，说明利用农杆菌介导的叶片侵染法进行外源基因快速表达的有效性。为了进一步确定外源基因是否在新生叶片和茎中被瞬时表达，我们对报告基因GUS进行的RT-半定量PCR检测。分别提取侵染叶片(侵染后第15天)和新生叶片的总RNA进行反转录，获得的cDNA作为模板进行报告基因的表达检测，结果显示: 在农杆菌侵染后第15天叶片和新生叶片中GUS都有表达(图2B)，说明利用农杆菌介导的叶片注射法可以实现外源基因在拟南芥中的表达。

1.3利用农杆菌介导法在拟南芥中表达HCPro

我们之前已经成功构建了pBI121-HCPro表达载体，为了进一步研究HCPro的功能，我们利用农杆菌介导法在拟南芥中瞬时表达HCPro。选取叶片舒展的拟南芥为植物材料进行注射侵染。以携带空载体的农杆菌侵染的拟南芥为对照(图3A)，表达HCPro的拟南芥植物的表型发生明显的变化。侵染后的第7天，被侵染的叶片表现轻度卷曲的症状(图3B)；侵染后的第10天，有的侵染叶片严重蜷曲变形，新生叶片表现为锯齿状(图3C)，与我们之前获得的HCPro转基因拟南芥植物的表型十分相似(Yang et al., 2016)，表明HCPro开始在新生叶片中表达。在侵染后的第14~15天，叶片边缘的锯齿状更加明显，部分叶片严重卷曲变形，并出现黄化和枯萎的叶片症状(图3D)。侵染后的拟南芥植物表型的变化暗示了HCPro表达改变了宿主内源基因的表达及基因表达的调控机制。提取侵染植物的总RNA，进行半定量RT-PCR检测，结果证实了HCPro在拟南芥中的表达(图3E)。

1.4病毒抑制子HCPro诱导YUC1基因表达

为了研究HCPro是否能够诱导生长素生物合成基因YUC1的表达，我们以侵染空载体的拟南芥和表达HCPro的拟南芥为材料，比较分析两种植物材料中YUC1基因的表达水平。分别提取两种植物的总RNA，半定量RT-PCR检测结果表明，在瞬时表达HCPro植株中YUC1基因的表达量显著上调(图4A)。研究结果进一步揭示，与侵染空载体的拟南芥相比，表达HCPro拟南芥中YUC1启动子区DNA甲基化水平有不同程度的降低(图4B)，三个位点中CG位点降低16.56%，CNG位点降低18.89%，CHH位点降低13.38%。结果表明HCPro介导了YUC1启动子区DNA去甲基化而激活其基因的表达。

2讨论

研究表明,马铃薯Y病毒(potato virus Y, PVY)编码的HC-Pro蛋白干扰了植物DNA甲基化 (Soitamo et al., 2011)，我们之前的研究结果进一步揭示病毒抑制子HC-Pro在植物基因组中的DNA去甲基化作用(Yang et al., 2016)。由于HC-Pro转基因植物具有败育的特征(Yang et al., 2016)，本研究中，我们建立了农杆菌介导的植物瞬时表达体系，为深入研究HC-Pro蛋白的功能奠定实验基础。来源于病毒的表达载体经常被用于植物中外源基因的瞬时表达。植物瞬时表达系统主要的侵染方法主要有农杆菌介导的叶片注射法和真空侵染法(Kapila et al., 1997)。例如：研究者利用病毒介导法在烟草中瞬时表达了酸性成纤维细胞生长因子(acidic fibroblast growth factor, aFGF)(Liu et al., 2007)。我们之前的研究利用来源于烟草花叶病毒(Tabaco mosic virus, TMV)的30B表达载体在烟草中瞬时表达了报告基因GFP(Yang et al., 2008)。这种方法具有快速和表达效率高的优势而被人们广泛应用。研究中我们利用农杆菌介导的叶片侵染法，在植物中进行外源基因瞬时表达的研究。这种方法主要通过农杆菌的传播和扩散，使其携带的表达载体和外源基因被快速表达。结果表明，利用这种方法成功表达了报告基因GUS和功能蛋白HCPro。

生长素生物合成基因YUC1主要在分生组织、幼原基和生殖器官中表达。本研究结果表明，以携带空载体的农杆菌侵染的拟南芥作对照，在瞬时表达HCPro的拟南芥植物中YUC1表达量明显增加(图4)。已有研究结果表明病毒和病毒抑制子能够干扰RNA介导的DNA甲基化(RNA directed DNA methylation, RdDM)途径(Jamous et al., 2011; Ivanov et al., 2016)。例如，BSCTV编码的病毒抑制子C2介导水杨酸防御途径上游调控因子ACD6启动子DNA甲基化水平显著降低，并激活SA途径(杨丽萍等, 2013)。我们之前的研究结果揭示HCPro能够介导DNA甲基化的降低并激活防御基因的表达(Yang et al., 2016)。本研究结果证实HCPro介导了YUC1启动子区域重复序列的三个位点DNA甲基化的降低(图4B)，并激活YUC1基因的表达，为进一步探索病毒及病毒抑制子与宿主的表观遗传调控互作机制奠定了研究基础。

3材料与方法

3.1材料与来源

拟南芥(Arabidopsis thaliana)种子和菌株由本实验室保存；植物表达载体pCambia-GUS由本实验室保存。

3.2农杆菌介导的拟南芥侵染

将EHA105-pBI121-HC-Pro农杆菌菌液活化，并于50 mL LB液体培养基中扩摇培养，加入20 μmol的AS和100 μmol的MES。4 000 r/min的条件下离心10 min，收集农杆菌。配置溶液(100 mL的ddH₂O加入1 mmol的MgCl₂, 1 mmol的MES和100 μmol的AS)，将农杆菌进行重悬，浓度为OD₆₀₀=1.0左右，农杆菌重悬液室温放置3 h后用于叶片侵染。利用去掉针头的注射器将农杆菌重悬液注入到叶片组织中，每株植物注射2-3个叶片。在黑暗条件下培养24 h后将植物转移到正常条件下培养。拟南芥的培养温度为为22~25℃。

3.3亚硫酸盐测序

利用CTAB法提取拟南芥总DNA，使用EpiTect Bisulfite Kit试剂盒(Qiagen)对纯化后的DNA进行亚硫酸盐处理。亚硫酸盐处理后的DNA样品作为模板，进行YUC1基因启动子区PCR扩增，并对PCR产物进行检测分析，由华大生物公司完成测序。

3.4半定量RT-PCR和定量PCR检测基因表达

我们利用TRIzol法提取植物的总RNA，半定量RT-PCR的检测，预变性：取2.5 μg的RNA，用ddH₂O调整到10 μL体系，先进性RNA进行预变性，预变性条件为：70℃处理5 min；4℃，5 min。预变性后的RNA进行反转录，以反转录后的cDNA为模板，进行PCR和定量PCR (qPCR)检测。

3.5 GUS染色分析

将GUS染色液与GUS染液缓冲液按照1：50的体积比配置成GUS染色工作液，-80℃下避光放置备用。将拟南芥植物材料放于50 mL的烧杯中，加入适量配置好的GUS染色工作液完全覆盖过植物材料，用锡箔纸将烧杯包好，利用真空侵染法进行染色。真空压力为0.08 MPa，时间5 min。观察到植物材料沉浸到GUS染液底部，重复两次实验。将整个烧杯置于37℃孵育24 h。随着孵育时间的延长，GUS表达的部位或位点呈现蓝色或蓝色斑点(整个过程均避光操作)。将植物材料用30 mL卡诺氏固定液在室温条件下固定1~3 h。然后进行脱色处理，设置乙醇的体积分数为25%、50%、70%、85%和无水乙醇，每个浓度下脱色处理1~3 h。显微镜下观察拍照。样本可以在75%的乙醇中4℃下保存1~3月。

作者贡献

金太成是本研究的实验研究的执行人，完成数据分析和论文稿的写作；杨丽萍指导实验设计，数据分析，以及完成论文的修改；郎晨婧、孟大伟、王悦和吴艳菊参与完成相关实验。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢

本研究由吉林省教育厅科研项目(JJKH20191013KJ)和国家青年科学基金项目(31301043)共同资助。

参考文献

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